固相多肽合成主要指的是将受保护的氨基酸衍生物连续添加到生长的肽链中，包括脱保护和洗涤步骤，以除去未反应的基团和副产物。如果每一步都是100%完成，那就会形成一个全长的肽，但是这种情况很难发生，因为无论合成方案如何优化，总是会存在副反应或者反应不完全的情况，从而影响肽的纯度。因此，提高肽纯度是固相多肽合成应用中的关键点。

01/如何测定肽纯度

肽纯度的测量通常使用反向高效液相色谱法（RP-HPLC）和质谱法（MS），另外，氨基酸分析也可用于计算肽的产量或实际量。

02/不同标准下肽纯度的应用

固相多肽合成过程中最常见的杂质主要包括以下几类：删除序列、截断序列、不完全脱保护序列、裂解过程中修饰的序列（肽上其他位置的保护基重新附着）、合成过程中形成的其他副反应产物（例如天冬氨酸亚胺形成、氧化产物等）、TFA（三氟乙酸）和乙酸等。

根据水平的不同，这些杂质中的一种或者多种会对您的应用产生直接影响。例如，特定的阶段序列可以干扰研究中的靶向结合，或者TFA可以杀死生物测定中使用的细胞。那么，首先必须对合成本身进行优化，以确保正确的分子种类被合成达到足够高的水平，使合成错误的、有问题的序列降低到非常低的水平。第二要优化下游的处理步骤，包括合成后盐交换的步骤，通常需要对乙酸盐进行药物的物质和分析测试。第三还要检查冷冻干燥的相对优势以及与将肽保持在溶液中的稳定性测试等。

2.1 合成不同纯度肽的应用指南

2.1.1 低纯度（>50%）：该水平适用于先导化合物的高通量筛选。如果您正在研究免疫应答，除去特定的污染物，>70%可以用于抗原制备。

2.1.2 中等纯度（>70%）：该水平足以生产、纯化和测试免疫测定中使用的抗体、进行酶底物研究、表位作图、亲和纯化、生物测定或其他免疫学应用以及肽筛选。生物化学和半定量应用可能需要达到>85%的纯度。例如酶学、表位作图或研究生物活性、酶-底物相互作用、磷酸化作用和蛋白质印记或细胞黏附中的肽封闭等。

2.1.3 高浓度（>90%）：该水平适用于定量生物测定、定量体外受体-配体相互作用研究、配体结合的生物活性研究、定量阻断和竞争性抑制试验、定量磷酸化和蛋白水解研究、电泳标记和色谱标准分析。

2.1.4 极高纯度（>98%）：该纯度适用于肽作为药物进行体内研究、临床试验、药物测试以及结构活性关系研究。

03/优化合成以达到所需浓度

实现特定应用所需的纯度意味着要******限度地提高正确偶联的效率，并******限度地减少副反应、缺失、外消旋化等。难度可能因肽序列不同而异。长肽（>30个氨基酸）和复合肽在合成时本身就存在很大挑战，一些特定区域（例如环状或支链残基）可能在合成过程中导致聚集，包括疏水性氨基酸或修饰。

3.1 合成前的关键优化步骤

3.1.1 序列分析：例如使用软件在合成之前进行合成预测，以确定在整个合成过程中是否存在合成难度很大的区域。

3.1.2 副反应风险评估：例如外消旋化。有许多策略可以降低副反应的风险或有助于提高单个偶联反应的效率，包括伪脯氨酸、二肽构建块、添加剂以及替代侧链保护。

3.2 固相多肽合成（SPPS）过程中关键步骤

3.2.1 树脂选择：SPPS通常在与1%二乙烯基苯（DVB）交联的聚苯乙烯上进行。替代品包括聚乙二醇（PEG）衍生物，树脂的选择会影响合成成功率和粗品的纯度。连接到柱上的连接物提供生长肽和固相载体之间的可逆连接，并确定最终产物的性质和可使用的化学性质。接头的选择决定了最终产物中的C端官能团。

3.2.2 偶联化学：选择通常取决于合成速度，较快的合成需要比较慢的合成（DIC、HBTU）更高反应性（=不稳定）的偶联试剂（HCTU、HATU和COMU）。反应温度会影响偶联化学的选择。

3.2.3 反应温度：提高温度可能会加快合成并提高纯度，但并不总是如此。需要注意的是，基于微波的加热只是加热，微波本身对合成没有特殊影响。

3.2.4 监控脱保护：能够通过实时紫外监测来监控，例如脱保护步骤的效率对于优化是非常重要的。

3.2.5 双重耦合：预测软件确定的困难耦合可以通过双重耦合、延长耦合时间或添加更多等效物来处理。

3.2.6 空间位阻：偶联试剂必须足够快速，以便可以引入空间位阻氨基酸。

3.2.7 封端：这样做是为了在偶联反应后永久阻断任何未反应的氨基，或使完整肽的N-末端乙酰化。它对于在合成困难或长肽期间最小化缺失产物和辅助纯化过程是有很用的。

3.2.8 溶剂使用：始终使用新鲜溶剂。重复使用溶剂会降低纯度。

04/选择一种能够快速合成高纯度肽的多肽合成仪

影响如何优化SPPS以获得所需肽纯度的一个主要因素是合成仪的选择。以下是一些帮助您选择的建议

4.1 用于筛选方法和试剂的平行反应容器

正如我们所看到的，优化可以涉及查看大量的变量，并行运行不同试剂组合的能力将大大加快优化过程。

4.2 脱保护监测

能够在运行期间监测脱保护步骤的效率，避免了可能导致不完全脱保护、缺失和副反应的情况。

4.3 温度控制

提高温度可以提高某些序列的纯度。能够同时测试不同温度对提高生产率能力的影响。

4.4 最小交叉污染

提供试剂或树脂交叉污染的多通道合成将加快优化并将再合成的风险降至最低。

4.5 稀有单体无需单次注射

特殊化学中使用的许多单体和试剂可能昂贵或珍贵，因此一些合成剂可从任何氨基酸/单体瓶位置提供免“单次注射”添加，以确保不会浪费任何东西。

4.6 合适的软件

如果在GxP设施中合成肽，则需要有为符合21 CFR第11部分而设计的软件。

Gyros Protein Technologies全自动多肽合成仪，具有独特的Peptide Predictor功能，可以模拟多肽合成的过程，并且进行评估；具有完备的安全响应设置，保障多肽合成的准确；矩阵式专利液体传送技术全面保障合成高效进行；并且结合Single-shot技术，可以避免试剂浪费和规避试剂交叉污染的风险；合成完成或合成中可直接自动原位切肽；并且软件系统方便快捷，可以帮助用户设计高效、灵活、直观的工作流程

该多肽合成仪可以定制固相多肽设计肽疫苗，开发肽类新药，还可以通过与核酸和多糖合成折叠体、合成肽核酸、制成类肽、合成寡核苷酸等方式，作为治疗剂或检测探针等应用于临床，有助于包括癌症、阿尔兹海默病等的疾病治疗。

目前在售的有Chorus、Symphony X和SONATA +三种不同型号的多肽合成仪。

   PurePep Chorus                           Symphony X               PurePep SONATA+