用于快速检测的表面等离子共振仪器——P4SPR是一款非常便利与研究人员快速开发生物测定方法和进行生物分子相互作用特征分析的日常工具。

下面简单介绍一下P4SPR的常见应用以及在应用上的优势。

一 DNA-蛋白检测——基因调控-Lac操纵子/Lac阻遏物

乳糖操纵子（LacO）是参与乳糖分解的一个基因群，调控乳糖代谢相关基因的表达，乳糖阻遏物（LacI）作为一种DNA-结合蛋白，是控制乳糖操纵子的关键。

利用P4SPR可以测定LacO/LacI体系的结合强度（亲和力，KD），其仪器使用简单，操作界面友好，非常适合实验室技术人员开发和本科课程教学。

图 1 SPR信号在不同浓度LacO下随时间的变化

图 2 增加LacI浓度时的叠加结合曲线

P4SPR成功地表征了Lac操纵子DNA及其抑制蛋白的结合相互作用，该系统也可以作为表征其他生物系统的有用工具，比如DNA-DNA、DNA-RNA和适配体等。

P4SPR的优势还体现在它具有独特的模块化、可移动性和多通道设计，用于药物发现、生物/传感和系统集成应用。并且几乎不需要样品制备，可以快速和简单的进行系统设置，同时还可以节省用户的试剂成本。

二 小分子检测——在环境水域中进行RDX的现场测试

环三亚甲基三硝铵（RDX）广泛用于弹药制造，也是爆炸污染的主要成分。

目前，对于RDX的检测通常采用实验室的HPLC-UV检测法，虽然这种方法十分灵敏，但是因为它需要在测试之前进行取样、运输、储存和样品准备等工作，因此耗时较长，需要几天甚至几周的时间。而利用P4SPR的便携性可以直接到现场检测RDX，仪器只需要进行简单的现场布置就能使用，并且能够直接检测，不需要样品制备，检测时间通常只需要几个小时。

图 3 用于RDX检测的传感器校准的SPR传感器图

图 4 SPR响应与10 nM标准进行归一化

图 5 RDX在不同温度下对10 nM下SPR响应的标准化校准曲线

P4SPR为RDX的现场检测提供了卓越的分析能力。它的便携性和稳定性使其适用于各种环境条件下的现场测试，因此还可以广泛适用于其他污染物的检测。

三 蛋白质-小分子相互作用——跨膜蛋白（TM）的作用机制

CD36是具有多种功能的跨膜蛋白的一部分，它在脂质摄取、细胞粘附和病原体感知方面有多种作用。配体/CD36蛋白的相互作用可能介导生物的信号转导。P4SPR具有无标签传感和实时监测的特点，这在研究生物分子相互作用以阐明通路方面表现出了明显的优势。

图 6 评估与CD36传感器芯片的小分子相互作用的SPR方法的示意图

图 7 指示化合物的KD和最大SPR信号（ΔλSPR,max）

P4SPR为了解跨膜蛋白与信息素刺激的作用机制提供了帮助，并且模块化设计提供了微流控系统，多通道特性提高了结果的精度，高灵敏度也允许检测低分子量的小分子物质，加上友好的操作界面，P4SPR非常适用于快速获取实时数据来表征分子间结合的相互作用。

四 蛋白质-蛋白质相互作用

急性淋巴母细胞白血病（ALL）是一种疾病，大肠杆菌l-天冬酰胺酶（EcAII）作为一种生物治疗药物是被证明对ALL有效的主要化疗药物之一。而患者可以通过产生抗体来中和EcAII，从而降低治疗效率。通过P4SPR可以有效检测抗体并且P4SPR具有可重复的传感器效率这一特点。

图 8 EcAII受体的固定化和免疫传感性能综述

图 9 EcAII变体的固定化。在注射40 μg蛋白（0.1mgmL−1）的肾折叠酶（黑色）或his标记的EcAII：N21-EcAII（绿色）、N26-EcAII（蓝色）和C8-EcAII（红色）后，观察EcAII变体表面固定的SPR传感器图

P4SPR操作的简易性可以让实验者快速评估分析参数，比如固定化方法对受体表面覆盖的影响以及传感效率。它的多通道性也提高了结果的精度，而且具有高灵敏度，非常有利于生物样本中的生物治疗药物的分析。与传统的酶联免疫吸附试验（ELISA）技术相比，P4SPR无需对样品进行标记预处理，并且使用试剂的量更少，制备步骤更简洁，可以减少检测的时间和试剂的成本。

五 抗体的快速质量检控

在进行抗体的质量检控时，传统的ELISA通常只能进行终点分析，而不能提供动力学和亲和力数据，表面等离子共振（SPR）技术可以实时评估蛋白质的相互作用并且不需要太多的样品制备。

P4SPR作为一种便携式的SPR设备可以让科学家更加快速并且容易地获得有价值的动力学和亲和力数据以验证质量，而不影响灵敏度和结合特异性。例如应用P4SPR可以轻松确定哪种抗体与SARS-CoV-2核衣壳重组蛋白具有最好的结合性能。

图 10 固定化SARS-CoV-2核衣壳蛋白检测抗核衣壳抗体的方案

图 11 第一次和第二次注射，同时从每个通道（绿色、红色、黑色）收集传感器图。参考通道为蓝色

图 12 所有3个通道（洋红色）的平均传感器图，参考通道为蓝色，每个传感器图代表了抗核衣壳抗体的不同来源

由于其检测的高精度和灵敏性，所以无论检测的蛋白是新的还是储存了一段时间，P4SPR都可以很好的区分其高活性和低活性，并且不需要太多的抗体样品制备，可以直接注射到仪器中，能快速确定哪个抗体源应该用于进一步的实验。因此，P4SPR也为其他类型的生物制药产品进行质量控制提供了一个快速和简单的替代方案。

六 蛋白质与蛋白质相互作用的快速筛选

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）几乎是几乎每一个生物过程的核心。在当对自身免疫性疾病多发性硬化症进行蛋白质-蛋白质相互作用分析时，就发现了几十种相互作用。

而绘制生物体的相互作用图谱是一项艰巨的任务。目前常用的高通量技术来绘制图谱很费力并且容易产生假阳性。SPR技术可以很好的弥补这一不足。

例如肠杆菌素是一种小分子铁螯合剂，其生物合成途径由6种蛋白质EntA-F组成。由于已经确定EntB和EntE在这一生物合成途径中相互作用，因此很可能有其他的PPIs发生。P4SPR可用于筛选参与大肠杆菌中肠杆菌素生物合成的PPIs。

图 13 传感器图显示了固定化蛋白质和注射的配体之间发生蛋白质相互作用（红色和白色），或没有相互作用（绿色和蓝色）

P4SPR还可以进行更多的PPI筛选，快速、准确的PPI筛选能力非常有助于治疗靶点的发现和药物开发。

七 片段化合物与蛋白质相互作用——药物发现

基于片段的药物发现已被确定为一种识别小化合物的策略，可进一步发展为先导物和临床候选物。平衡解离常数（KD）表明了一个片段（或配体）与在靶标疾病中起关键作用的蛋白质的结合亲和力的程度，是一重要检测参数。

传统的微量热泳动技术（MST）、核磁共振技术（NMR）和等温滴定量热法（ITC）经常用于验证潜在的片段筛选。但是MST需要荧光标记，而疏水荧光团可能通过非特异性结合干扰配体-蛋白质的相互作用；ITC的通量相对较低，需要大量的样本，而且运行每个样本可能需要几个小时；NMR是一种无标签的方法，但只适合于评估较弱的粘合剂（mM到µM范围）。

表面等离子体共振（SPR）作为辅助片段筛选验证的新技术。虽然SPR需要目标蛋白的固定化步骤，但它使用了低数量的样本。可以快速实时确定配体-蛋白复合物的亲和信息。P4SPR可以在不到2小时内提供准确的结果。

图 14 在P4SPR中测定片段和固定在传感器芯片上的his标记蛋白之间的KD

图 15 传感器图显示了配体在40µM时与两个通道中固定化蛋白的实时结合数据（红色和白色曲线）

图 16 通过绘制RU与µM中浓度的SPR变化来测定KD

P4SPR能够快速评估片段和蛋白质之间的KD。通过4个微流控通道，一次最多注射4个重复样品可以获得准确的KD。相同浓度的样品可以在相同的传感器芯片上进行注射，从而降低消耗品成本。最重要的是，这些数据显示了在自己的研究实验室中，省去了预定的步骤，并且连接到我们的KNX2模块可以测定Kon和Koff以提供动力学数据，这是药物设计的重要参数。因此，P4SPR非常有助于药物发现。

八 疫苗监测——血凝素检测

血凝素（HA）的含量是流感疫苗监测的重要指标。目前评估疫苗批次的黄金标准方法是单径向免疫扩散（SRID）试验。虽然这一方法从1978年就开始使用，不过仍存在一定的局限性，首先它是一种离线的方法，需要将样品从流水线取下进行单独分析，其次，SRID所需的参考血清和抗原试剂可能需要6个月的准备，导致向公众发布疫苗批次的时间大大延迟，同时，SRID存在低精度和低通量的不足，并且一次检测大约需要22小时。

SPR是一种更快速准确的评估流感和其他疫苗效力的方法。

图 17 在A、B和C通道的三次HA滴定注射以及控制通道D（蓝色）的传感器图

图 18 HA与抗HA抗体结合的标准曲线

P4SPR可以通过固定抗HA抗体到芯片上，并使用标准曲线来检测样品中HA的数量。每个样品只需10分钟即可获得数据。在疫苗生产过程中，安装一个在线SPR仪器来实时评估疫苗批次将是有利的。