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利用BioXp™3200基因打印机系统的力量抗击由SARS-CoV-2引起的COVID-19

       鉴于COVID-2019造成的全球医疗紧急情况,加快创新步伐和开发工具来应对COVID-19的传播至关重要。科学界正在发挥其最大的创造力,以识别和推进预防,检测和治疗的解决方案。BioXp™3200系统是使全球研究人员能够快速合成SARS-CoV-2基因组部分的理想平台,使它们易于用于开发疫苗,诊断和治疗方法。

SARS-CoV-2是传染病COVID-19的致病因子,COVID-19已经被认为是全球大流行疾病。SARS-CoV-2感染了成千上万的人,夺走了全世界成千上万人的生命[1]。SARS-CoV-2也与2002-2003年导致SARS大流行的病毒密切相关,共有约80%的基因组的相似性[2]。该病毒的主要传播途径是通过感染者产生的呼吸道飞沫传播。密切接触(<〜6英尺)会增加人与人之间传播的机会(导致在社区内可以迅速传播),从而使该病毒具有高度传染性。预期世界卫生组织(WHO)已宣布COVID-2019爆发为全球性公共卫生突发事件,并将其确认为全球大流行[3]

SARS-CoV-2,类似于SARS和MERS爆发的致病因子,是长度约为30kb的单链正链RNA基因组,是RNA病毒中最多的病毒之一。冠状病毒是一类由外套膜包裹的正链RNA 病毒,具有螺旋对称的衣壳和外套膜结构。冠状病毒基因组为线性单股正链RNA,5' 端为甲基化的帽状结构,3' 端具有 poly( A) 尾巴,长度在 27 ~ 32 kb之间,是目前已知的 RNA 病毒中最长的 RNA 链[4-5]。SARS-CoV-2 的RNA基因组( 如图 1 所示) 全长在 26000~32000 个碱基之间,Roujian Lu 等人根据从病人样本分离得到的 6 组病毒基因组分析预测SARS-CoV-2至少有 12 个编码区,包括非结构蛋白开放阅读框( open reading frame,ORF) 1ab、3、7、8、9、10b、13、14 和 4 个结构蛋白刺突( S) 蛋白、膜( M) 蛋白、包膜( E) 蛋白、核衣壳( N) 蛋白[6]

SARS-CoV-2冠状病毒颗粒 (如图2所示) 是由一个正链的 RNA 基因组和 4 个结构蛋白 S、E、M 和 N 组成。磷酸化 N 蛋白组成病毒核衣壳,该蛋白被埋在磷脂双层中,并被S覆盖。M蛋白和E蛋白位于病毒包膜的S蛋白之间,构成了病毒体。

根据基因序列分析,SARS-CoV-2在遗传学上与 SARS-CoV 和MERS-CoV的同源性分别为 79%和 50% [6]。对比SARS-CoV 和MERS-CoV 序 列,SARS-CoV-2 在非结构蛋白区域 ORF3、ORF6、7 和 8,以及结构蛋白E、N,特别是 S 蛋白的差异[7],导致SARS-CoV-2在病毒靶向宿主和免疫反应能力上的改变,进而影响了SARS-CoV-2的毒力和传播能力,提示对于 COVID-19临床用药、疫苗开发以及疾病防控策略,应在两种冠状病毒病的基础上进行调整[8]

到目前为止,尚无疫苗或治疗药物可抗击SARS-CoV-2。生物学,特别是DNA书写技术,可以快速研发预防剂(疫苗)和治疗剂(单克隆抗体)。此外,DNA书写可以生成用于诊断试剂盒和测定开发的质量有保证的材料。

经过合理重新设计的全长减毒基因组有助于开发针对该病毒的疫苗。另外,病毒基因组部分有助于产生抗原的抗病毒抗体,从而可以开发出可以有效治疗感染患者的治疗方案选择。研发疫苗,诊断剂和治疗剂的开发对于阻止这种感染的传播是必不可少的。

在本应用笔记中,我们描述了SARS-CoV-2整个基因组的按需生产。基因组部分是使用BioXp™3200系统设计合成的。我们还描述了这些部分的连接以装配SARS-CoV-2的全长基因组作为大肠杆菌中的细菌性人工染色体(BAC)。鉴于到目前为止已经确定了SARS-CoV-2的基因组变异体的数量(https://nextstrain.org/ncov),可能有必要将其迅速纳入疫苗,治疗和诊断开发流程。3200系统通过在仪器的单个通宵运行中快速合成多达32个独立的变异基因组部分,从而加速了这一流程。

在BioXp™3200系统上设计和合成SARS-CoV-2基因组部分Codex的专有设计软件使用重复,GC流量,GC含量等参数计算序列复杂性,并合理设计了SARS-CoV-2基因组的分阶段构建(约30kb)。该工具能够手动添加添加独特的GibsonAssembly®限制性核酸内切酶位点之后的序列(30bp)。在组装的所有三个阶段中这些特征允SARS-CoV-2基因组片段的扩增和克隆(图3)。设计完成后,我们下了订单,在三个工作日内收到了寡核苷酸板和专有试剂。

图3:SARS-CoV-2基因组的分层装配方案。 

使用三个组装阶段合成基因组:在BioXp™3200系统上完成24 X〜1.4 kb的第一阶段组装,然后将6 X〜5.3 kb组装成第二阶段分子和〜30 kb第三阶段基因组。

  我们将寡核苷酸板和试剂加载到BioXp™3200系统上,并启动了自动生成的程序。BioXp™运行始于每个片段的初始构建,然后进行错误校正,I级分子的扩增和DNA片段的纯化。BioXp™3200系统成功生成了构成整个SARS-CoV-2基因组的所有24个片段(图4)。

图4:使用BioXp™3200系统组装SARS-CoV-2基因组。

(A)在BioXp™系统上合成的24Xstage I分子然后组装成Stage II和Stage III分子。

(B)使用限制性核酸内切酶处理从BAC释放〜30kb SARS-CoV-2基因组后,使用FIGE分析分析携带III期分子的克隆。

(C)沿着侧分子量标准克隆到BAC中的完整基因组的超螺旋DNA分析(显示了来自单个代表性克隆的DNA分析)。

全长SARS-CoV-2基因组的层次组装

使用GibsonAssembly®HiFi套件(Codex目录 no. GA1100),我们克隆了第I阶段的分子(〜1.4 kb),并使用Sanger测序(GENEWIZ)对其进行了测序。我们使用GibsonAssembly®HiFi试剂盒将三个连续的,将第I阶段分子组装成第二II阶段分子,并通过PCR扩增了产物,然后按尺寸选择产品。使用GibsonAssembly®Ultrakit(Codex no.GA1200)将这些II阶段分子进一步组装成SARS-CoV-2的全长基因组,并使用BAC进行克隆。通过菌落PCR和场转化凝胶电泳(FIGE),我们验证了克隆在BAC中的整个基因组的存在。通过在适当的分子量标准下,在无溴乙锭的1%琼脂糖凝胶上4.5V/cm电泳180分钟,通过电泳分离超螺旋DNA,进一步可视化整个克隆的基因组。

BioXp™3200系统和工具使我们能够构建SARS-CoV-2的整个基因组,从设计到最终组装。

 使用Codex专有的设计工具创建了构建SARS-CoV-2基因组所必需的三级程序集的计算机硅制图。具体来说,我们将SARS-CoV-2的整个〜30 kb基因组分为了第一阶段分子(24 X〜1.4 kb)二十四个部分。我们通过BioXp™套件订购门户订购了具有独特末端的这些零件。交付后,我们将试剂加载到BioXp™系统上并执行运行。经过16小时的运行,成功生成了包含SARS-CoV-2基因组的所有24dsDNA片段。我们使用GibsonAssembly®方法克隆了片段,并使用Sanger测序分离了无错误的克隆。

通过GibsonAssembly®方法将三个连续的I期克隆合并为II期分子(〜5.3 kb),然后进行PCR扩增和大小选择。我们使用GibsonAssembly®方法将由此获得的六个II期分子组装成BAC。接下来,我们使用菌落PCR筛选了96个菌落,并验证了III期组装基因组中II期分子的存在。然后,我们通过菌落PCR选择了24个阳性鉴定的克隆。我们从中提取了SARS-CoV-2BAC,并使用限制酶消化从BAC中释放了基因组。使用FIGE分析释放的片段。我们测试的所有24个菌落均带有〜30 kb插入片段,表明SARS-CoV-2基因组的存在。我们对其中的几个菌落进行了超级螺旋DNA分析,从而可以可视化以环形分子形式克隆到BAC中的SARS-CoV-2基因组。所有测试的菌落均经过验证以包含全长基因组(图4)。

以前,食品法典委员会的科学家开发并部署了合成DNA技术,以通过产生菌株特异性抗原部分来应对流感的年度威胁[9]。SARS-CoV-2基因组变体的新威胁将触发合成生物学的类似用途,以合成抗原的多种菌株特异性变体,例如刺突蛋白。BioXp™3200系统和工具是一种破坏性技术,可加快发现疫苗,诊断方法和治疗方法的速度。BioXp™3200系统具有高度精确的合成dsDNA分子的能力,并能够实现快速的设计和合成迭代循环,它将扩展研究人员针对人类,牲畜和植物的其他传染原的发现能力。

参考文献

[1]https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/
[2] et. al. Direct RNA sequencing and early evolution of SARSCoV-2. bioRXiv 2020        doi:https://doi.org/10.1101/2020.03.05.976167
[3] https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019

[4] VAN R M,MAYO M,FAUQUET C,et al. Virus nomenclature: consensus versus chaos [J]. Arch Virol,2000,145:2227-2232.

[5] SCHOEMAN D,FIELDING B C. Coronavirus envelope protein: current knowledge

[6] LU R J,XIANG Z,JUAN L,et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implicationsfor virus origins and receptor binding [J / OL]. Lancet,2020,https: ∥doi. org / 10. 1016 / S0140-6736 ( 20) 30251-8.

[7] NING D,XUE M Y,LIAN W Y,et al. Genomic and protein structure modelling analysis depicts the origin and infectiv-ity of 2019-n Co V,a new coronavirus which caused a pneumonia outbreak in Wuhan,China [J / OL]. Biorxiv,2020,https: ∥doi. org / 10. 1101 / 2020. 01. 20. 913368.

[8] 吴雅玲[1],陈 骐[2],王德民[3].SARS-Co V-2 和新型冠状病毒肺炎:发病机制与药物开发研究进展.福建师范大学学报 ( 自然科学版). 1000-5277( 2020) 05-0102-15

[9] Dormitzer et. al. Synthetic generation of influenza vaccine viruses for rapid response to pandemics. Sci Transl Med. 2013 May 15;5(185):185ra68. doi: 10.1126/scitranslmed.3006368