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微流控扩散技术——膜蛋白研究新方法

背景


膜蛋白是生物膜功能的主要执行者,在生物体内参与许多重要的生理过程。但是,由于很难获得稳定均匀且维持膜蛋白正确构象的膜模拟环境,膜蛋白研究远远滞后于水溶性蛋白。磷脂纳米盘(Nanodisc)是由高密度脂蛋白发展而来的用于膜蛋白研究的新类型膜结构。将膜蛋白与Nanodisc组装起来,是膜蛋白研究的有效方法。制备纳米盘的一种常用方法是将苯乙烯-马来酸(SMA)添加到完整的细胞膜上,从而自发地生成SMA-脂质颗粒(SMALP)的纳米盘1

微流体扩散分级(MDS)使用微流控分析芯片将蛋白质样本送入一个通道,在这个通道中,蛋白质样本与辅助流体一起以稳定的层流状态流动,没有混合。蛋白质从一个流层转移到另一个流层的唯一途径是扩散,扩散的速率与蛋白质的大小流体动力学半径Rh成正比。Rh的改变表明分子结合事件的发生。


摘要

在本应用中采用MDS技术的Fluidity one-W检测到了SMALP纳米盘的形成,而且揭示了SMA与脂质体的比例是如何影响SMALP纳米盘的大小,这是表征嵌入膜蛋白的一个关键参数。

低SMA/脂质体比例下,SMALP纳米盘开始形成。随着SMA/脂质体比例的升高,单层囊泡开始降解,大的异质性SMALP逐渐形成。在更高的SMA/脂质体比例下,SMALPs的平均流体动力学半径(Rh)缩小了4.5倍,这使得其内嵌的脂质大大减少了。

纳米盘这种大小变化极大地改变了内嵌膜蛋白周围的环境,因此在生物物理和生化应用中需要加以考虑。

因此,对于研究或使用SMALPs,以根据实验需求调整SMALP大小的研究人员来说,Fluidity one-W是一个理想的工具。

方法

1.制备荧光标记的脂囊泡

1-棕榈酰基-2-油酰-SN-甘油-3-磷酰胆碱(POPC)和1-棕榈酰-2-(二吡啶甲基硼二氟)十一烷基酰-SN-甘油-3-磷酸胆碱(TopFluor® PC; both Avanti Polar Lipids)混合,得到1 mol% 的TopFluor PC。

氯仿蒸发,脂质膜干燥过夜,加入PBS缓冲(pH值7.4),得到总脂质浓度10mM。10 mM脂质(POPC / TopFluor PC 1 mol%)穿过孔隙大小100 nm的聚碳酸酯膜30次,得到荧光标记大单层囊泡(LUVs)。

通过动态光散射分析得到的荧光标记LUVs,其z-平均流体动力学直径为118±7 nm,多分散性指数为0.2±0.08。

2.制备SMALP纳米盘

PBS (pH7.4)稀释苯乙烯-马来酸(SMA 3:1)共聚物原液。为分析纳米盘的形成,将LUVs与SMA以不同比例混合,在21℃温度下孵育至少2小时。Fluidity One-W检测样品。

结果

在微流控芯片上,当样品通过芯片时,记录未扩散样品(Fundiffused)和扩散样品(Fdiffused)的荧光强度。

没有加入SMA时,完整LUVs的荧光信号比(SR),SR=Fdiffused/Fundiffused,为~0.15,为低扩散水平。


相比之下,在SMA存在的情况下,荧光SR值为0.75,表明大的LUV转化为小得多的微小纳米盘,引起了更高水平的扩散。

为了分析SMA与脂质的比例如何影响SMALP纳米盘的大小,不同浓度(25 µM, 50 µM 和100 µM)的荧光标记LUVs与SMA混合。

当SMA/脂质≥0.08时,SR的增加表明SMA从LUVs中提取脂质,形成小颗粒物,与完整的LUVs共存。

SMA /脂质= 0.15时, LUV完全溶液化2。根据Fluidity one-W检测结果,SMA /脂质= 0.15时, SMALP纳米盘平均Rh是20 nm;随着SMA比例的提高,最小Rh为4.5 nm 。

根据测量的Rh值,确定了纳米盘的半径(Rdisc) 3。假设POPC-双分子层厚度为4 nm4,那么Rh值为20 nm和4.5 nm时,Rdisc值分别为26 nm和5 nm。

这种Rdisc的变化可直接转化为嵌入的脂质的数量。

结论

Fluidity one-W利用MDS技术,直接在溶液中检测分子结合事件,是一种通过微量样品检测SMALP纳米盘形成的理想工具。SMALP纳米盘的平均流体动力学半径根据SMA/脂质比例不同从20 nm到4.5 nm不等。这种大小的变化将显著改变任何嵌入蛋白周围的脂质环境,因此在纳米盘研究中至关重要。

采用微流控扩散(MDS)技术的Fluidity one-W是一款非常实用的分子互作仪。研究人员可以在溶液中以及在复杂的生物学背景(例如粗裂解液或血浆中)研究蛋白质相互作用。还可以分析难以研究的蛋白质(例如膜蛋白质,多蛋白质复合物和固有紊乱的蛋白质)的相互作用,其中许多蛋白质都是重要的药物靶标。此外,由于它报告了结合和未结合物质的绝对大小,因此可以与结合亲和力同时评估化学计量和结合性质,从而全面了解结合事件。


//亲和力检测

//蛋白稳定性检测

//化学计量参数检测

//直接检测血清中抗体浓度和亲和力

//膜蛋白分子互作最佳检测方法

//在溶液中直接检测,更接近天然状态

//非表面结合原理,无需担心非特异性结合

//兼容细胞裂解液、培养基、血清等复杂的溶液背景

参考文献

1、Dörr,      J.M.; Scheidelaar, S.; Koorengevel, M.C.; Dominguez, J.J.; Schäfer, M.;      van Walree, C.A.; Killian, J.A. The Styrene-Maleic Acid Copolymer: A      Versatile Tool in Membrane Research. Eur Biophys J Biophy. 2016, 45, 3-21.      (publication)

2、Vargas,      C.; Cuevas Arenas, R.; Frotscher, E.; Keller, S. anoparticle self-assembly      in mixtures of phospholipids with styrene/maleic acid copolymers or      fluorinated surfactants. Nanoscale.      2015,      7, 20685-20696. (publication)

3、Glover,      K.J.; Whiles, J.A.; Wu, G.; Yu, N.; Deems, R.; Struppe, J.O.; Stark, R.E.;      Komives, E.A.; Vold, R.R. Structural evaluation of phospholipid bicelles      for solution-state studies of membrane-associated biomolecules. Biophys. J. 2001, 81,      2163-2171. (publication)

4、Kučerka,      N.; Nieh, M.P.; Katsaras, J. Fluid phase lipid areas and bilayer      thicknesses of commonly used phosphatidylcholines as a function of      temperature. BBA-Biomembr.      2011,      1808, 2761-2771. (publication)