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Nanolive无标记显微镜揭示病毒感染活细胞的3D病变效应

瑞士Nanolive公司开发的Nanolive 3D CX 显微镜采用三维全息断层扫描显微技术(DHTM),该技术发表于2013年自然光学期刊【Cotte et al., Nature Photonics7 (2013) 113–17.】。Nanolive 3D CX采集样本物理学折射率图像,实现定量无标记观察;采用1类激光光源,波长520nm,温和低功率0.2mW/mm2,相当于欧洲中部太阳辐射的五分之一,因而可对样本进行几乎无干扰的实时连续观察,克服了光毒性及光漂白影响的问题。

细胞病变效应(CPEs)是感染发生时的一种细胞学特征。因为光毒性的存在,当采用传统光学显微镜对细胞进行长期连续的观察时,难以客观评估细胞病变效应(CPEs)。苏黎世大学的格雷博小组通过数字全息断层扫描显微技术(DHTM),发现了病毒侵染活细胞时的不同模式。全息断层扫描显微技术(DHTM)观察样本时无需标记,简化样本处理流程;低能束激光通过透明样本时记录相位差,从而使得长期连续显微观察时光毒性的问题一并解决。该技术(DHTM)可测量折射率(RI),并计算折射率梯度(RIG),从而揭示细胞的光学异质性。通过研究,格博雷小组发现,痘苗病毒(VACV)、单纯疱疹病毒(HSV)和鼻病毒(RV)感染细胞可渐进性的增加折射率梯度(RIG),且三种感染的折射率梯度(RIG)的变化趋势与程度因病毒而不同。痘苗病毒感染,而非单纯疱疹病毒、鼻病毒感染,会导致细胞体积的振荡性收缩与膨胀。三种病毒感染均改变细胞膜动态,导致的凋亡特征类似于星形孢菌素的效果。作者指出,全息断层扫描显微技术(DHTM)作为定量无标记显微镜进行活细胞感染研究,在最小扰动的条件下揭示了具有病毒特异性的变化与细胞病变效应。

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折射率梯度(RIG)计算


折射率梯度(RIG)描述了三维立体空间中特定立体像素与相邻单元之间折射率(RI)的改变,如上图所示,中心深蓝色立体像素的折射率梯度(RIG)基于各维度相邻浅蓝色立体像素的折射率(RI)测算,计算公式如下:


折射率梯度(RIG)由Nanolive 3D CX 系统配套软件STEVE计算分析。

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细胞体积测量:

细胞体积测量由软件STEVE及Imaris完成。如上图A所示,为了衡量基于DHTM的体积测量的准确性,研究小组采用0.5um、0.75um、2um、4um的聚苯乙烯珠球进行了评估。聚苯乙烯珠球成像后的体积测算,采用两种不同的分析方法,Nanolive 3D CX 系统配套软件STEVE,是以像素为基础的方法;第三方三维图像分析软件Imaris,基于对象的的三维切面分割方法。如上图B所示,两种方法分析结果接近,Imaris分析更准确一点.

Nanolive 3D CX 连续观察动态视频

1,细胞形态与体积动态观察(灰阶图像)


无侵染发生HELA细胞,在长达8小时的连续观察中,细胞体积恒定。

而痘苗病毒(VACV)侵染的HELA细胞,细胞体积经历了振荡性的收缩与膨胀。链接视频1:痘苗病毒(VACV)侵染HELA细胞体积变化。

视频链接:https://v.youku.com/v_show/id_XNDYyMTg4OTgwOA==.html

 

2,药物处理抑制鼻病毒诱导的折射率增加(数字染色图像)。其中,细胞膜绿色标记,高折射率与高折射率梯度区域红色标记。

相对于无侵染HELA细胞,鼻病毒(RV)侵染HELA细胞为代表的折射率梯度(RIG)显著增加了2.5倍(视频链接2);当研究小组使用抑制剂MLN9708(10uM)处理鼻病毒感染细胞时,可以明显挽救折射率梯度(RIG)增加的表型(视频链接3)。

视频链接2:鼻病毒(RV)侵染HELA细胞折射率梯度(RIG)变化

视频链接:https://v.youku.com/v_show/id_XNDYyMTg5MDI2OA==.html

视频链接3:鼻病毒(RV)侵染HELA细胞,MLN9708(10uM)处理后细胞折射率梯度(RIG)变化https://v.youku.com/v_show/id_XNDYyMTg5MDU2MA==.html

 

 


 

2,药物处理抑制鼻病毒诱导的折射率增加(数字染色图像)。其中,细胞膜绿色标记,高折射率与高折射率梯度区域红色标记。

相对于无侵染HELA细胞,鼻病毒(RV)侵染HELA细胞为代表的折射率梯度(RIG)显著增加了2.5倍(视频链接2);当研究小组使用抑制剂MLN9708(10uM)处理鼻病毒感染细胞时,可以明显挽救折射率梯度(RIG)增加的表型(视频链接3)。

视频链接2:鼻病毒(RV)侵染HELA细胞折射率梯度(RIG)变化