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华中农大---OpenSPR揭示锌指蛋白ZFP217通过介导m6A mRNA甲基化导致肥胖

过去三十年来,全球肥胖和2型糖尿病的发病率有所上升,而脂肪组织是肥胖相关疾病的重要因素,因此,控制脂肪细胞分化和成熟可能是治疗肥胖相关疾病的一个有希望的策略(1)。为了阐明转录和表观遗传调控在脂肪形成中的作用,并确定一个主要的关键调控因子和途径(1,2),人们做了大量的努力,然而,转录后调控在脂肪形成中的作用尚不清楚。

锌指蛋白217(Zfp217,人类同源蛋白ZNF217)是一种在多种人类肿瘤(4,5)中上调的已知致癌蛋白,也是胚胎干细胞分化的关键蛋白(3,7,8)。值得注意的是,Zfp217将基因转录与新生RNA上的m6A修饰紧密结合,提示Zfp217在协调表观遗传和表观转录网络中的关键作用(3,9)。虽然我们之前确定了一个新的角色对于脂肪发生中的Zfp217,详细的Zfp217依赖机制尚未得到很好的描述(10,11)。然而,这些研究增加了Zfp217可能通过调节m6A修饰来加速脂肪生成的可能性。

 

为了阐明Zfp217蛋白在脂肪生成中的作用,华中农业大学动物科学与技术学院动物营养与饲料科学系的彭建教授团队,通过sRNAi、CRISPR/Cas9、Co-IP, OpenSPR  LSPR技术等实验方法, 最终确定Zfp217通过介导m6A mRNA甲基化编排转录和转录后调节,促进了脂肪分化并将该结果于2019年4月发表于《Nucleic Acids Research, 2019》(IF 11.5)。

 

 

具体实验内容

 

通过sRNAi、CRISPR/Cas9、流式、Co-IP, LC-MS/Ms、Chip等实验方法,发现Zfp217,YTHDF2 , FTO, m6A RNA之间在脂肪生成过程中形成了一个调控环路, Zfp217缺失会抑制脂肪生成,并通过OpenSPR的LSPR技术检测确定了不同因子之间相互作用关系:

1)提取总RNA定量PCR分析,对m6A做点杂交及质谱分析发现RNAi及CRISPR/Cas9处理后缺失了Zfp217的细胞中, m6A修饰水平明显增加;LC-MS/Ms 发现 m6Am在Zfp217缺失的细胞中显著增加,m6A是m6Am的10倍,意示m6A可能是主要的关注点;点杂交实验显示,m6A的水平没有变化。但是缺失Zfp217的细胞中,m6A 修饰显著增加,暗示Zfp217对m6A RNA甲基化起关键的作用;并且pull-down实验显示FTO 和YTHDF2与m6A ssRNA 竞争结合,CO-IP检测发现Zfp217 与 YTHDF2存在相互作用。

 

2)LSPR 检测:为了确定Zfp217 与 YTHDF2是否是直接相互作用及阐明上述三者之间的关系,本研究利用Nicoya OpenSPR 的LSPR技术,YTHDF2固定在芯片上,检测了Zfp217与YTHDF2、、m6A ssRNA 三者之间的相互作用情况,结果显示Zfp217 与 YTHDF2之间亲和力很高,是直接相互作用,并且Zfp217会阻止包含m6A的 ssRNA与 YTHDF2的结合(图2),这个数据科学直观的解析了后期关于Zfp217与YTHDF2相互作用以使FTO 能与m6A结合 ,从而增强了FTO对m6A RNA的定位和去甲基化酶活性(图1)。

 

 

 

总的来说,这项研究首次证明了Zfp217在脂肪生成中的复杂作用。Zfp217与m6A去甲基化酶FTO的启动子直接结合,并与m6A“阅读器”蛋白YTHDF2相互作用,从而增强了FTO对m6A RNA的去甲基化酶活性。最终,Zfp217以依赖于m6A-YTHDF2的方式促进脂肪生成(图3)。

 

参考文献

 

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