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分子间相互作用分析:荧光标记VS无标记

       在之前的文章中(领往昔风云,看今日OpenSPR、Biacore和Fortebio孰强孰弱),我们通过实验对比了市面上主流的无标记分子间相互作用检测技术。今天我们来聊聊基于荧光标记的分子间相互作用检测技术。


       同无标记技术相比,利用荧光技术检测分子间相互作用的实验成本较低,例如荧光共振能量转移和凝胶迁移实验,无需昂贵的仪器便可完成结合分析。然而,基于荧光标记的检测技术也存在自己的局限性,像凝胶迁移实验就只能用来检测蛋白和核酸间的相互作用。那么在具体的实验中,研究人员该如何选择合适的检测技术呢?不要着急,下面我们便为大家介绍最常见的荧光结合分析技术,为您提供一些思路。

荧光偏振(FP)


       荧光偏振技术利用偏振光激发探针上的荧光基团,根据探针迁移状态的不同,发射光为偏振光或非偏振光。例如生物大分子旋转相对较慢,由偏振光激发后会产生偏振信号。而小分子由于旋转较快会导致信号去极化。通过分析发射光的偏振信号强度便可快速定量分析分子间的相互作用及酶活性检测。

荧光偏振技术非常适用于高通量筛选实验,但是不能得到结合动力学参数(结合/解离速率常数),且荧光基团可能会对分子间的结合产生影响,需要用其他技术手段加以验证。中南大学湘雅医学院发表的文章Luteolin inhibits Musashi1 binding to RNA and disrupts cancer phenotypes in glioblastoma cells就是利用该技术高通量筛选靶向癌症相关蛋白的小分子抑制剂,之后使用我们的LSPR技术进行验证。

荧光共振能量转移(FRET)

       荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中,如果一个荧光基团(供体 Donor)的发射光谱与另一个基团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠,当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于100Å),就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。这样我们就可以检测分别带有供体和受体基团的融合蛋白间的相互作用。同其他技术相比,FRET最大的优势是可用于研究活细胞生理条件下的蛋白间相互作用。但可检测的样品种类较少,目前仅适用于蛋白、核酸的检测。同样,由于荧光基团的介入,可能会对分子间的相互作用产生影响。

凝胶迁移实验(EMSA)


       凝胶迁移实验又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一种用于蛋白与核酸相互作用检测的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验,也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。EMSA主要基于蛋白-探针复合物在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针,当核酸探针与样本蛋白混合孵育时,样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物;这种复合物由于分子量大,在进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则较快;孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后,若蛋白-探针复合物在膜靠前的位置形成一条带,则说明蛋白与目标探针之间有相互作用。

EMSA技术门槛、实验成本都比较低,但仅适用于蛋白和核酸的互作检测,实验流程相对繁琐。在Novel dual regulators of Pseudomonas aeruginosa essential for productive biofilms and virulence这篇文章中,研究人员首先使用EMSA检测蛋白与核酸间的相互作用,在发现蛋白与核酸间的相互作用需要辅助调节因子参与后,使用我们的LSPR技术进行了快速的验证。

微量热泳动(MST)


微量热泳动技术使用红外激光进行加热产生一个微观的温度梯度场,导致分子定向移动,再通过共价结合的荧光染料或色氨酸自发荧光来监测观测区域的荧光信号的变化从而计算两个相互作用分子间的KD等常数。MST技术不需要表面固定,可以在溶液中检测任何生物分子、化合物、纳米材料等分子间的相互作用,应用范围较广。但无法提供结合动力学参数(结合/解离速率常数),且共价结合的染料可能会对分子间的相互作用产生影响。

综上所述,同无标记分子间相互作用检测技术相比,基于荧光标记的分子间相互作用检测技术有以下共同点:

无法提供结合动力学参数(结合/解离速率常数)

荧光基团可能会对分子间的结合产生影响

通常需要使用其他技术验证

表面等离子共振技术(SPR)作为分子间相互作用检测金标准,无需对生物分子进行标记,检测数据更加精确。除了两个分子间亲和力大小外,还能提供结合动力学参数(结合/解离速率常数),帮助研究人员更加深入的理解生物结合过程、药物作用机制。加拿大Nicoya公司的OpenSPR极大的减低了传统SPR仪器的操作难度,同时采用简单稳定的光学系统及大孔径流路,让使用者远离高昂的维护费用。

Nicoya OpenSPR分子相互作用仪在研究中的优势


多参数检测---Ka、Kd、KD、EC50、蛋白浓度测定

创新LSPR技术--- 检测不受温度、缓冲液折射率影响

易操作---1-2小时快速掌握

宽范围检测---pM-mM

低成本--- 实时无标记、芯片可再生