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Vala细胞成像分析系统实现高通量筛选出导致心脏毒性的络氨酸激酶抑制剂

  酪氨酸激酶抑制剂(TKIs),是有效的抗癌治疗药物,但对心血管存在副作用,包括从诱发心律失常到心力衰竭等。


        为了筛选出存在副作用的TKIs,斯坦福大学医学院坦福德心血管研究所和干细胞生物学及再生医学研究所的教授们,通过用11名健康个体和2名接受癌症治疗的患者的特异性人诱导多能干细胞衍生心肌细胞(hiPSC-CMs)做模型,采用Vala science 公司的KIC 超高速高通量细胞分析仪测量了心肌细胞活力、收缩力的变化及用膜片钳等对细胞电生理学、钙处理和信号等检测,对FDA批准的TKIs进行了心脏毒性筛选,利用KIC超高速高通量细胞分析仪获得关键性细胞收缩数据,证实了VEGFR2/PDGFR抑制性TKIs在临床相关浓度下可诱导hiPSC-CMs产生心脏毒性,开发出了一个评估现有TKIs心脏毒性的“心脏安全指数”,并将该结果发表在Sci Transl Med(IF16.2)杂志上,标题为:《High-Throughput Screening of Tyrosine Kinase Inhibitor Cardiotoxicity with Human Induced Pluripotent Stem Cells》


具体实验

        为了研究FDA批准的TKIs对hiPSC-CMs的心脏毒性,研究时招募了11名健康个体和两名接受TKIs癌症治疗的个体。通过皮肤打孔活检或血液抽取,以获得产生hiPSC的主要组织样本:皮肤成纤维细胞或外周的hiPSC-CM,之后细胞培养在人白蛋白和抗坏血酸的培养基中,这种心肌细胞培养基缺乏胰岛素和IGF1等生长因子;分化的细胞是葡萄糖饥饿型并需要补充5mM DL-乳酸钠用于从代谢上选择hiPSC-CMs。获得的纯hiPSC-CMs,以25000细胞/孔的浓度种在384孔板,并用0~100μm TKIs处理72小时,并测定了细胞活力。



图1

之后采用Vala KIC 高通量细胞分析系统快速测定hiPSC-CMs收缩性

        用hiPSC-CMs细胞对21小分子TKIs进行高通量心脏毒性筛选。许多TKIs抑制多个RTK家族并诱导心脏毒性包括左心室功能不全、心肌梗死或心律失常。然而,癌症治疗的效应大于这些风险,而这些药物也经常在主要的癌症治疗中心为指定药物。以高心脏毒性的蒽环类,阿霉素作为阳性对照 ,使用PROSTOBLAST细胞活力测定发现VEGFR2/PDGFR抑制性TKIs 如索拉非尼、雷格列尼、和脑啡肽诱导大多数hiPSC-CMs细胞死亡,LD50分别为3.4μm、7.1μm和4.3μm(图2A)。阿霉素在0.78μM的 LD50 毒性非常大. TKIs与细胞毒性没有很强的关系, 如伊马替尼和厄洛替尼的LD50分别为78.20μm和87.60μm,通过定量细胞活性试验证实索拉非尼、雷戈拉非尼和波那替尼对11个健康对照的hiPSC-CM细胞系均具有高度细胞毒性(图2A~2C;图S3)。


       之后还对来自两个患有肾癌的人hiPSC CMS和hiPSC ECS进行了细胞毒性试验。这些患者接受两个TKIs:舒尼替尼作为一线治疗,阿西替尼作为二线治疗。发现这些患者对任何TKIs都没有明显的临床心脏毒性 。正如所预期的,接受TKI治疗的患者hiPSC-CM和健康对照hiPSC-CM在对予舒尼替尼或阿西替尼后细胞毒性方面没有观察到显著差异。

       为了避免实验室对实验的偏差和hiPSC-CM质量的变化,我们用商业化的健康hiPSC-CMS,经TKIs处理72小时,之后用Hoechst 33258(Life Technologies,H3569)及Alexa-Fluor 488标记物处理细胞15min,通过Vala Sciences 公司的KIC200动态成像细胞仪以100Hze的成像速度,按6.5秒为一个时间段,成序列性对384孔板的细胞进行收缩性评估。观察了用诸如尼洛替尼和凡地他尼等TKIs治疗的细胞,在低于LD50细胞毒性值的剂量下,hiPSC-CM搏动速率和其他参数的变化,发现心肌细胞死亡之前会出现不规则搏动(图2B,图5)。还测定了增加TKI浓度后hiPSC-CM收缩力参数的改变、最初出现收缩力改变的有效药物浓度和hiPSC-CM细胞停止收缩的TKI浓度(图2C,图56,图7)。为了准确评估TKIs的毒性,同时考察了有毒的TKIs浓度即用Vala KIC系统观察了细胞毒性和收缩性是否与患者体验剂量匹配。并从FDA文献中获得患者Cmax值,做为患者TKI血浆浓度的估计指(图2C)。通过将体外停止跳动的有效浓度和LD50细胞毒性数据与文献报道的Cmax值做均一化,我们开发了一个“心脏安全指数”,即鉴定临床心脏毒性的TKI度量(图2C,图7)。7分之3的药心脏安全指数在0.10或更低 (阿霉素、尼洛替尼和万德他尼),之前被FDA标示为黑匣子心脏毒性警告。0.10的安全指数值选择作为高心脏毒性药物的阈值,以此作为临床心脏毒性药物和黑盒子药物(阿霉素、尼洛替尼和万乃他尼)及其他与心脏毒性不相关的化合物之间的安全指数分界点。尼洛替尼和万乃他尼两种黑盒型TKIs引起QT间期延长和心律失常,被选择做进一步分析。3个安全指标在0.10以下的TKIS 是VEGFR2/PDGFR抑制性TKIs(瑞格拉尼布、索拉非尼和万乃他尼)。瑞格伐尼布和索拉非尼具有与心脏毒性蒽环类阿霉素相当的安全性指标。VALA  KIC200细胞分析仪的这些统计结果表明,VEGFR2/PDGFR抑制性TKIs在临床相关浓度下可诱导hiPSC-CMs发生心脏毒性,与患者经历的剂量相当。临床上,VEGFR2/PDGFR抑制性TKIs可引起多种心血管毒性,包括高血压、心力衰竭和QT延长。


        通过磷蛋白分析,还确定VEGFR2/PDGFR抑制性TKI导致hiPSC-CMs中保护性胰岛素和类胰岛素生长因子(IGF)信号补偿性增加。心脏保护信号上调外源性胰岛素或IGF1,改善了心肌炎VEGFR2/PDGFR协同抑制性TKIs的hiPSC-CMs生存能力。

        因此,VALA KIC 高通量细胞分析仪的数据还证实hiPSC-CMs可用于筛选与抗癌TKI相关的心血管毒性,并与临床表型相关。这种方法提供了意想不到的见解,并且毒性可以通过心脏保护性胰岛素/胰岛素样生长因子信号获得减轻。



VAlA  KIC 实时超高速细胞分析系统细胞心脏毒性药物筛选中的优势:

★超高成像速度:0.1-1500Hze,适合细胞收缩跳动分析

★单细胞分析: 实时最早单视野或多视野的每个细胞

★双聚焦成像:表面追踪+图像对焦,保证每个细胞图像清晰

★高通量: 96/384孔等高通量分析,最快1-2min/96孔 

★标配4荧光通道及双物镜,通道及物镜皆可拓展