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OpenSPR改进肽筛选研究方法

在任何治疗开发项目的第一阶段,有必要使用一个完善的模型系统来审查比较新的治疗药物。用一个稳定的模型系统来比较新的治疗方法。建立模型系统将为有效的筛选分析提供基础,从而使研究者能够有效地比较和对比他们感兴趣的治疗剂的各种生物学变化。重要的是,透明质酸介导的运动受体,也被称为RHSMM,通常在乳腺癌,结肠直肠癌和前列腺癌中过表达。它已被证明可作为六种癌症标志中的两个即血管生成和侵袭/转移的贡献者。值得注意的是,RHAMM已被确定为一些高度侵袭性癌症的生物标志物。在这方面,因此,开发靶向RHAMM的高特异性治疗药物可以抑制血管生成和侵袭/转移,从而限制某些侵袭性肿瘤的扩散。不幸的是,重组蛋白质技术的使用对于足够的生产和分离全长RHAMM蛋白质而言基本上是无效的,而这对于体外结合研究却是至关重要的。

Leonard Luyt博士等人,使用OpenSPR局部表面等离子体共振技术获得了他们最新发现的癌症治疗开发所需的关键性数据,并于2018年9月发表文章,标题为“A truncated RHAMM protein for discovering novel therapeutic peptides”,通过OpenSPR获得的数据观察其化学合成的7kDa RHAMM“mini-protein”的结合行为,其被工程化并用于筛选候选的治疗性肽。


摘要

RHAMM是一种大的95kDa碳水化合物结合蛋白,负责许多细胞过程,包括细胞运动,组织修复和引发先天免疫反应。 然而,当过表达时,RHAMM已经在两种主要的致癌过程中被发现,包括刺激血管生长(血管生成)和细胞侵袭和扩散(侵袭/转移)。 从历史上看,对于有意义的体外研究,全长RHAMM非常难以生产和分离。 由于它在肿瘤发生中起着重要作用,因此很明显RHAMM对于研究至关重要。

此外,透明质酸(HA)是高分子量多糖,并且在细胞外基质中以高浓度存在。在片段化时,HA倾向于积累并且先前的研究已经证明这些片段化累积模式在血管生成过程中是同源的。 RHAMM倾向于结合HA并随后与CD44(和一些生长因子受体)相互作用。反过来,激活了许多已知的癌症途径,包括RAS,ERK和MEK途径。这些途径主要负责不受控制的细胞生长,血管生成和细胞运输等。值得注意的是,上述途径依赖性事件是六个癌症标志中的三个。值得注意的是,生产和分离全长RHAMM蛋白很难,加上HA-RHAMM在随后的致癌途径中的结合的影响,表明需要开发一种替代系统来筛选潜在的RHAMM治疗干扰物。


在该文章中,研究人员通过Fmoc固相肽合成了7kDa RHAMM“mini-protein”,随后使用圆二色谱分析了截短的RHAMM的结构。 应该注意的是,截短的RHAMM mini-protein被设计为仅包含HA结合位点,但也设计了没有HA结合所需的关键残基的阴性对照。 在合成和结构分析后,然后使用OpenSPR表面等离子体共振检测了7kDa的 RHAMM mini-protein与其天然配体HA之间的结合动力学和亲和力常数。 此外,许多已知结合重组RHAMM的微管蛋白衍生的HA肽类似物也用于验证合成的RHAMM mini-protein的结合能力。

重要的是,Nicoya的SPR研究结果证明,7kDa RHAMM mini-protein是产生和分离全长重组RHAMM的极好替代品,因此未来对这一重要致癌因子的研究要求低得多。

OpenSPR对这项研究的帮助

表面等离子体共振(SPR)用于解析截短的RHAMM蛋白,HA和微管蛋白衍生的HA肽类似物之间的相互作用。 值得注意的是,在OpenSPR上进行了许多实验,并使用了许多不同的表面化学传感器芯片。 首先,将普通金芯片与胱胺功能化的HA一起孵育3天,并阻断以防止非特异性结合。 功能性RHAMM mini-protein和相应的阴性对照(Ala-RHAMM)用作分析物。 随后,将具有C末端His标签的RHAMM mini-protein固定在NTA芯片上,并使用所有微管蛋白衍生的HA肽类似物作为分析物进行检测。

重要的是,该结合数据清楚地表明化学合成的RHAMM mini-protein可以作为筛选用于破坏RHAMM-HA-CD44结合反应的抗癌肽候选物的有效替代品。 在这方面,OpenSPR结合数据提供了定量证据,表明可能不需要生产和分离重组全长RHAMM蛋白的繁琐工作。 此外,通过使用OpenSPR,研究人员能够从他们自己的实验室平台获得SPR数据,以帮助他们加快研究并更快地公布他们的发现。

SPR是一项无标记的检测技术,研究人员可以定量分析两种生物分子之间的结合。 SPR技术使我们能够确定相互作用的kon,koff和KD,与仅提供终点测量的其他技术如pull-down实验相比,更能深入了解分子间的相互作用。 SPR不仅对于发表文章是必要的,而且对于许多医学和医学研究领域的发展也是必要的,如下图所示,近几年,依靠SPR数据发表的文章数量呈显著增长。


Scientific publications involving SPR have increased drastically over the years. SPR has become fundamental for publications while traditional techniques like Western Blots are becoming less important.

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