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Biopen助力肌球蛋白Ⅱ调节轻链在活细胞内磷酸化动态过程的定量观测

     调节轻链(RLC)的磷酸化引起非肌肉肌球蛋白Ⅱ(NMMⅡ)与肌动蛋白纤维的汇合,从而导致肌动球蛋白细胞骨架的形成与收缩。NMMII在细胞骨架动力学过程中发挥重要作用,但是如何在亚细胞水平精确的调控RLC的磷酸化水平仍旧未知。

目前的研究手段并不适合用于观测活细胞及生物体内的RLC磷酸化。例如使用双色荧光共振成像技术的局限在于:占用大部分可用光谱导致无法兼容其它光学传感器并且存在光毒性与光漂白现象。本研究开发了一种同源FRET方法用于观测荧光蛋白标记的RLC磷酸化。


如图1A所示,磷酸化导致RLC二聚体的解离,减弱FRET,异向性增加。将融合有荧光蛋白的RLC转染至成纤维细胞分别培养在玻璃皿及镀有纤连蛋白的玻璃皿中,发现镀有纤连蛋白的实验组异向性显著升高。并且RLC突变体AA(缺少磷酸化位点)实验组的异向性明显降低。


      接下来使用mCherry-RLC来探究活细胞内RLC-FRET的动力学。MLCK能够磷酸化RLC,如图2A所示,ML-7处理抑制MLCK活性后,mCherry-RLC的异向性明显降低。将mCherry-RLC同MLCK FRET生物传感器共表达,使用KCL激活MLCK后,细胞质内mCherry-RLC的极化也同样增加。


      接下来,研究人员需要进行单细胞刺激以观察亚细胞水平的肌球蛋白磷酸化动态过程。在细胞收缩前,细胞外突出包含稳定的高异向性磷酸化区域(图3B),之后使用Biopen对细胞外突出进行PDGF刺激,瑞典Fluicell公司的单细胞微流控给药系统Biopen采用高端的微流控技术可以在显微镜下精确的控制液体覆盖范围,如图中若丹明红色染料所覆盖区域即为本次实验的刺激区域首先,细胞骨架收缩10-20μm(图3C,白色箭头),收缩前端的RLC异向性的提高(图3C,粉色箭头前方),肌球蛋白的去磷酸化,包括收缩前端(图4C,粉色箭头下方)和内部(图3C,蓝色箭头)。整个过程收缩边缘肌球蛋白RLC的异向性改变定量统计见图3D,mCer3-RLC(AA)边缘的异向性无明显改变,野生型的RLC异向性明显降低。


      Biopen利用吸入流的流速高于注入流的流速所形成的表面张力,自动形成液流回路,将细胞培养体系与灌流液体通过虚拟边界分离,产生局部液流腔。液流腔的大小可控制在培养细胞或组织中单个细胞周围的环境。5-25nL/s亚秒级的给药速度,可实现4种不同药液的快速切换。

借助于我们的单细胞微流控给药系统,研究人员完成了单细胞水平的肌球蛋白磷酸化研究,建立了一种兼容多种不同荧光蛋白与生物传感器的检测方法,可以说Biopen实乃单细胞研究领域的一大利器!


Biopen 技术优势

★精确的单细胞或多细胞药物环境控制分子

★低药物消耗,35µL/孔

★4种溶液快速切换

★无需清洗

★非接触式给药,无污染

★枪头顶部非玻璃材质高分子软性材料,不易碎,避免损伤细胞;

★最大限度利用培养的细胞;

★兼容各大品牌正倒置显微成像系统;


Biopen 应用领域

★酶学;

★电生理;

★药理;

★组织病理;

★药物发现;

★生物打印;