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Nicoya OpenSPR 在酶类研究中的创新应用------ β羧化β-碳酸酐酶结构对γ-碳酸酐酶结合的影响



碳酸酐酶CcaA是蓝藻细菌羧酶体的组成成分。CcaA含有特征性的未知功能的C末端延伸,通过与γ-碳酸酐酶(CcmM)的相互作用被整合到羧酶体上,在很多蓝藻细菌中CcmM是具有酶活性的碳酸酐酶的同源体。我们已经从集胞藻属中确定了CcaA的结构。与大多数细菌碳酸酐酶的二聚体结构或者植物酶中丢失的二聚体结构不同,CcaA展现很好的三聚体结构




为了探索碳酸酐酶CcaAγ-碳酸酐酶(CcmM)相互作用机制,2017年圭尔夫大学分子与细胞生物学系的Matthew S. Kimber团队在《BIOCHEMICAL  JOURNAL》发表了他们的研究成果,研究发现CcaA / CcmM复合物的形成可能需要至少在一个结合配对区移动重要支柱。表面等离子共振技术表明CcaACcmM以亚皮摩尔的亲和力,通过CcmM's αA的螺旋区和CcaA'sC末端尾部形成复合物。催化特征表明,相对γ-碳酸酐酶CcmMCcaA是至今为止最不活跃的β碳酸酐酶,其即可补充也可被替代有趣的是,C末端尾部显示出部分的抑制活性,可能会减少封装的酶的活性。






为了进一步研究CcaA / CcmM复合体形成机制本次实验首先设计引物扩增CcaA274CcaA220基因,之后插入PET 载体表达,之后通过加拿大Nicoya公司的OpenSPR仪器LSPR技术)检测蛋白与蛋白的亲和力。为突出CcaA C末端尾部的作用,实验过程检测了CcaA274CcaA220CcmM206的结合情况,并以前两者作为配体固定到COOH芯片上,用标准的EDCNHS激活芯片,CcaA浓度范围为15-50μg/mL,运行速度20μL/min,分析物浓度(CcmM206CcmM206-4A; 0.12-29.9μg/mL),运行速度20-150μL/min;同时还调查CcaA结构对CcmM206-4A(含Q159A/H161A/D168A/Q170A四个氨基酸的突变体)的结合影响,结果用TraceDrawer 软件分析,获取的 CcaACcmM的动力学结果如下表:






LSPR检测结果显示CcaA274CcmM206-4A 结构的亲和力降低了9倍,表明CcmM αA周围的冗余侧链通过CcmM在调节CcaA结合中起重要的作用,尽管这些单独的侧链不是必须的,并且CcaA220CcmM206-4A的结构结合也变弱,而CcaA274CcmM206的相互作用力很强。证明了CcmM-4A的结构对亲和力有很明显的影响作用。同时也证实CcmMC末端β螺旋可能对相互作用决定性作用。整个实验过程操作简单,检测速度非常快,获取的动力参数,科学客观的数据透彻的解析了CcmM末端β螺旋在与CcaA相互作用中的决定性作用。