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新技术传递----Nicoya 新一代SPR 技术在钙调蛋白与NOS研究中的应用 EF手性对突变钙调蛋白与一氧化氮合酶结合域肽段相互作用研究

新技术传递----Nicoya 新一代SPR 技术在钙调蛋白与NOS研究中的应用

EF手性对突变钙调蛋白与一氧化氮合酶结合域肽段相互作用研究


Department of Chemistry, University of Waterloo, Waterloo, Ontario N2L 3G1, Canada

 

一氧化氮合酶(NOS)是一种非常重要的生物小分子NO合成催化酶,一氧化氮合(NOS)包括三个同型酶:神经酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。每种酶产生的NO分别用于神经传递、血管舒张和免疫应答一氧化氮合酶是通过钙调蛋白结构阈将N末端氧化酶结构域和c-末端结合域形成的同源二聚体蛋白。


一氧化氮合酶(NOS)能催化L-精氨酸生成NO及在几个关键的生理过程中起主要作用,钙调蛋白(CaM)是小的泛素化Ca+2偶联蛋白,用于激活(NOS);钙调蛋白通过EF手性变化与Ca+2结合,但钙调蛋白激活NOS的机制还不完全清.

目前用于CaM与NOS 相互作用研究方法较为复杂、耗时。为此,加拿大waterloo大学的John通过niocya 公司最新开发LSPR 实时无标记检测技术分析了不同EF手性对突变的CaM与NOS相互作用,对比CaM与NOS 的结合亲和力,对通过简单方法获得的 CaM-NOS作用结果进行了动力学数据不错,揭示CaM通过EF手性对突变激活NOS! 并将该成果与研究方法在2017化学生物物理学研讨会进行了分享。

CaM是一种体积高度动态的,具有催化Ca2+结合的蛋白,几乎存在所有真核生物体中,激活NOS的活性是必要的。它由一个可变的中心连接子区连接的球状N末端和c-末端结构域构成,每个区域CaM 通过2对EF-手性基序与Ca2+结合可以结合4个Ca2+,这些基序对于相互结合及NOS的活性是必须存在的 



为:CaM 的Ca2+不同结合状态(A)Apo-CaM  (B) HOLO-CaM  (C) HOLO-CaM结构紧凑 


图为:不同的CaM EF-手性突变后结构示意图


根据之前实验获取的一些信息,John团队利用Nicoya 的LSPR 专利技术产品OpenSPR实时无标记技

术对CaM与NOS的激活机制做检测;实验过程先对经电泳验证过表达的CaM纯化并做了质量鉴定,之后用于与NOS相互作用研究。

CaM纯化后SDS-PAGE 分析结果


蛋白结合分析 NOS固定OpenSPR的纳米金芯片表面,并对CaM做浓度梯度检测,结果导入TraceDrawer分析。 


OpenSPR实时检测,梯度稀释后不同浓度检测出野生型CaMnNOS(红线)和eNOS 肽(紫红线)的结合情况,观察结合、解离及再生的整个过程,结果显示实验曲线稳定及信号显著。




 不同突变的CaM 与cNOS结合数据导入TRACE  DRAWER 软件分析,获取Koff、 Kon及 KD值,结果如下:



结果显示CaMcc与cNOS 的亲和力高于wt CaM,相对wt CaM,所有突变型的CaM除了nCaM及CaMcc,与NOS解离速率都加快,并且结果与之前传统方法得出只有CaMc能激活NOS,其他激活效果差或不激活的结果一致,也有效的证明了OpenSPR 在CaM 与cNOS结合研究中的准确性,并且检测方法简单,数据结果丰富,首次阐述了CaM激活cNOS激活机制是因CaM发生了EF手性对突变,利用这个方法下一步继续验证CaM激活eNOS及iNOS 的机制

(1)Alderton etal.Biochem.J. (2001)357:593

(2) Babu YS,Bugg CE ,Cook  WJ:J.Mol.Bio.(1988)204:191-204

(3) Spratt.D.E.et FEBS(2006)273,1759-1771