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一种Co-IP的代替方法 ----15min出结果的神秘武器!

一种Co-IP的代替方法

----15min出结果的神秘武器!

分子间相互用是细胞接受信号和传递信号的基础,是研究药物作用的本质所在,因此研究分子间的相互作用对于揭示生命起源、细胞病变、药物开发等是不可忽视的过程,也是当前生命科学与医药领域的研究热点;传统研究分子相互作用的方法众多,包括酵母双杂、噬菌体展示、ElisaWesternFRETCo-IPPulldown及无标记SPR 技术,在目前所有标记技术中Co-IP 实验比较常用,其可以直接分析来自体内的特定蛋白之间是否存在相互作用,但是具有很多局限性且实验效率低。相比之下,实时无标记SPR技术作为研究分子互作的新秀,在分子互作研究中具有诸多优势!

下面我们具体聊聊CO-IPSPR之间的差别:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation),简称 Co-IP,是体外利用特定抗体沉淀相应抗原,并将与该抗原相互结合的其他分子共同沉淀的方法,之后通过western 杂交鉴定与抗原相互作用的蛋白,也可与质谱联用,主要用于研究蛋白质相互作用。可用于确定特定蛋白天然状态下的结合情况,也可通过质谱找到未知蛋白

CO-IP实验流程图




Co-IP技术中,由于手动步骤较多,因次实验会受到操作者的影响;

且具有以下局限性:

1.早期的琼脂糖beads因颗粒小,离心后容易被搅动起来,因此wash步骤很 难掌控。

2.Beads损失或残留多余液体,会使靶蛋白损失或产生假阳性信号。

3.孵育时间过长导致杂蛋白进入beads孔隙被洗脱出来,影响背景。

4.对于亲和力低的瞬间的蛋白与蛋白的互作不易检测到。

5.实验过程繁琐,耗时将近两天。

6.重复性差,很难取得重复性结果。

SPR 技术即表面等离子技术,采用实时无标记的检测方式,倍受科学家们的青睐;来自Nicoya的下一代SPR技术即LSPR 技术(Local Surface PlasmonResonance)即局域表面等离子共振技术,基于纳米金颗粒的检测技术,通过检测溶液中的分子与固定到芯片表面配体结合时引起的光的吸收峰的变化,分析分子之间的相互作用,只需保证配体和分析物有一个是纯的物质,即可像Co-IP 一样分析特定蛋白天然状态下的结合情况,并且同样可以和质谱联用,分析结合相中的未知蛋白,帮助快速找到靶标,在分子互作研究领域脱颖而出。






SPR 技术检测蛋白分子互作时,只需通过简单的几个步骤,如只需将蛋白X的抗体固定到芯片上,之后注入蛋白X即可将其沉淀下来,并同时与 X 在体内结合的蛋白质 Y 或者 Z 等也能共同被沉淀下来。并利用双抗夹心法验证YZ 蛋白,时间最快只需15min,也可洗脱分析相上质谱、测序仪分析未知的蛋白或核酸,将传统Co-IP 2天的实验缩短到15min,并且还可获得跟多数据如动力学参数,评估蛋白活性、表达量、相互作用强弱等;且检测样本类型涵盖多肽,抗体,核酸,适配体,纳米材料,小分子等相互作用的动力学分析。 

在SPR技术中,无需微珠,无需标记,也不必担心操作原因引起实验失败;检测灵敏度高,获得的动力学参数可做更深入的机制分析,相对Co-IP 具有很多独特的优势:


SPR优势: 

 1. 操作步骤简单,无需电泳、转膜等繁琐步骤

 2. 检测周期短:15min出结果

 3. 无需标记、实时结果检测

 4. 实验人为因素小,重复性高

 5. 多数据获取:动力学参 Ka,Kd,KD


综合比较SPR与CO-IP实验:

相同点:

1)测定两种甚至更多种蛋白质是否在体内结合;

2)鉴定一种特定蛋白质的作用搭档;

3)分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。


传统SPR技术的仪器使用复杂,让很多老师望而却步,加拿大Nicoya公司的下一代的LSPR专利技术系统OpenSPR,其以操作简单但不失精确结果的独特优势正逐渐占领市场,且LSPR的成本甚至低于CO-IP,并在实验周期和重复性上具有很大优势。

自我们普瑞麦迪20168月正式引进到中国后,全国知名高校争先试用,目前清华,北大,中科院,二军大、上海交大、西安交大、南京大学、军科院、四川大学、西南大学等都已试用,并取得良好的反响和申报计划。武汉大学、山东大学、北大肿瘤医院、西南大学等已成功申购我们的OpenSPR





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