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细胞培养技术

ES 细胞培养

原代胚胎成纤维细胞(ME)的制备

1. 取12.5-13.5dpc孕鼠,断颈处死;

2. 将鼠腹面向上放置,70% 酒精润湿、消毒腹部(防止腹毛飞扬,污染内脏及子宫),剪开皮肤层、肌肉层,打开腹腔,将连接在子宫上的结缔组织及脂肪剪去,将子宫取出,转入无菌10cm平皿中;

3. 把平皿转入超净台;

4. 用镊子打开子宫壁,挤出鼠胚,并与胚外组织、胎盘等分离,除去鼠胚的头、四肢及各种内脏(主要为肝脏、肺脏、心脏和肠胃等);

5. 将鼠胚移入另一新的无菌皿,用PBS洗三次;

6. 弃去PBS,用弯头剪将鼠胚剪碎,加入PBS洗至溶液基本无色(1-4次);

7. 加入适量Trypsin-EDTA(0.25% Gibco 25520,下同),体积约等于组织块体积;

8. 用滴管轻轻吹匀,室温下消化1-10分钟(或消化至溶液浑浊变粘),加入与消化液等体积培养基,轻轻吹打混匀(5-10次),静置;

9. 沉降后将上部溶液轻轻吸出,转入离心管中。

10. 将细胞悬液管离心(1000转5分钟);

11. 弃去上清,向沉淀中加入适量培养基,轻轻吹打重悬,将其分种至10 cm细胞培养皿,补加适量培养基,作标签(ME-0;注意:若冻存,则可以使用复苏后的0代ME制作Feeder;若直接使用则最好不用0代ME细胞做Feeder,要传到一代以后再用来制作Feeder比较好),转入培养箱培养;

12. 视细胞生长情况换液(一般3天换液一次),若细胞已长满,则冻存,或者1:3-5传代(视细胞疏密而定),放入培养箱继续培养(此后不用再换液);1-5代的ME细胞均可用来制作Feeder。

饲养层细胞(Feeder)的制备

注:含10 ug/ml丝裂霉素C的DMEM血清培养基(FBS占10%)(实验室所用MMC为10 mg/mL,Calbiochem)

1.弃去细胞培养皿中的培养液,加入适量含10ug/ml丝裂霉素C的培养基(DMEM+10% FBS);

2. 放入培养箱培养3小时(2-4小时);

3. 用0.1% 明胶处理培养皿(将明胶加入,摇动使明胶覆盖全部皿底,然后吸出明胶弃去即可),室温放置2小时以上,至皿底明胶干燥为止;

4. 弃去含有丝裂霉素C的培养基,加入2-3 mL PBS,轻轻摇动,弃去PBS,如此洗3-5次(必须洗3次以上,以便彻底洗去残存的丝裂霉素,丝裂霉素是有丝分裂抑制剂,因而对ES细胞有毒性);

5. 加入适量胰酶消化30秒,吸去消化液,静置至细胞层出现裂缝或明显滑壁为止,加入培养基,吹打,种至明胶处理过的培养皿中即可(如细胞过稀,可再补加丝裂霉素处理过的细胞),半小时后即可使用(如果急用,则可以用ES细胞培养基终止消化,然后与ES细胞一起转入明胶处理过的新板上),可使用6-10天,用前更换培养液(如未用明胶处理培养皿,则需在培养箱中放置2小时以上方可使用;最好是前一天下午制作Feeder,第二天上午使用,这时的Feeder状态最好,最适于ES细胞贴壁生长,而且万一制作的Feeder在第二天早上发现出了问题,还可以赶紧补做)。

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